原标题：GPP患者外周血单个核细胞甲基化酶及甲基化CpG结合蛋白mRNA的表达水平

作者：朱腾，晋红中

单位：中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院皮肤科

通讯作者：晋红中

文章来历：协和医学杂志，2019,10(4):358-363.

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81773331）；中国医学科学院医学与健康科技立异工程（2017-I2M-B&R-01）；中心保健科研课题（W2017BJ21）

泛发性脓疱型银屑病(generalized pustular psoriasis，GPP)是一种体系性炎症性皮肤病，以忽然呈现的红斑以及红斑基础上粟粒巨细无菌性脓疱为首要特点，严峻时可危及生命［1］。跟着GPP遗传研讨的不断深化，IL36RN［2］和CARD14［3］被以为是GPP的致病易感基因，但一起也存在一些无法解说的临床现象，如部分带着IL36RN骤变基因的个别体现正常［4］，IL36RA缺点病（deficiency of IL36 receptor antagonist，DITRA）患者的发病年纪存在较大差异［5］, 感染、妊娠、特别药物运用等要素均能诱发GPP发作［6］。这些临床现象用致病易感基因无法彻底解说，而甲基化调控机制易受环境等要素的影响，在体系性红斑狼疮等本身免疫性疾病中发挥重要效果［7］，但有关GPP的甲基化研讨较少。

DNA甲基化是重要的表观遗传调控机制之一，在很多生物学进程中发挥要害效果［8］。DNA 甲基转移酶 (DNA methyl-transferase，DNMT)在调理基因甲基化进程中起重要效果［9］，可分为保持型甲基转移酶及重生型甲基转移酶两类［10］。DNMT表达的改动可导致甲基化状况反常化。一类含有相同甲基化CpG结合域（methyl-CpG binding domain，MBD）并能与甲基化润饰后的DNA特异性结合的蛋白被称为甲基化CpG结合蛋白（methyl-CpG binding protein, MeCP),又叫MBD蛋白宗族，包含MBD1、MBD2、MBD3、MBD4和MeCP2［11］。MBD蛋白可选择性地结合存在甲基化润饰的序列，使得某些转录因子无法接近，导致基因表达缄默沉静。

本研讨首要调查GPP患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中DNMT及Mecp mRNA的表达，评论DNA甲基化在GPP发病中的效果和机制，为GPP医治供给新的头绪。

1材料与办法

1.1研讨目标

回忆性选取2015年12月至2016年12月在北京协和医院皮肤科门诊或住院医治的9例GPP患者作为研讨目标，同期在北京协和医院体检中心承受体检的10例健康人做为对照。GPP病况严峻程度按Umezawa评价规范进行评分，分为轻度（0~2分）、中度（3~6分）和重度（7~10分）［12］。

1.2当选和扫除规范

GPP患者：

（1）具有典型皮损并经病理承认，契合Umezawa确诊规范［12］；

（2）就诊时处于脓疱发作期；

（3）抽血前2个月内未运用糖皮质激素、维甲酸类、生物制剂及免疫按捺剂等药物；

（4）扫除红皮病型、关节型及寻常型银屑病患者；

（5）无其他类型皮肤病、肿瘤、其他本身免疫病或严峻疾患。

健康对照：

（1）无GPP病史及银屑病宗族史；

（2）不伴肿瘤、其他免疫相关性皮肤病或其他严峻疾病；

（3）2个月内未承受其他体系性药物医治。

本研讨经过中国医学科学院北京协和医院道德审查委员会审阅同意，患者入组前均签署知情同意书。

1.2荧光定量PCR

1.2.1提取外周血单个核细胞

取患者和健康人肘正中静脉血10 ml，运用密度梯度离心法（3000 r/min，20 min）提取PBMC，参加1.5 ml Trizol溶液后冻存于-20 ℃冰箱。

1.2.2引物规划

选用Roche LCPDS2软件规划基因DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD3、MBD4和MeCP2的引物(表1），由上海捷瑞生物工程有限公司组成。

1.2.3外周血单个核细胞总RNA提取

将上述冻存的PBMC Trizol溶液取出冻结。每1 ml冻存液中参加200 μl氯仿，剧烈震动15 s后冰孵15 s。在4 ℃条件下以13 000 r/min离心15 min。离心后样品分3层，RNA首要在水相中。当心将RNA水相转移至新的微量离心管中，并汲取400 μl备用。参加等体积异丙醇沉积水相中的RNA，倒置混匀，-80 ℃过夜。次日在4 ℃条件下以13 000 r/min离心30 min，白色沉积即为RNA。汲取上清液，剩下RNA沉积用预冷的75%乙醇洗刷，使RNA沉积悬浮。依旧在4 ℃条件下以1000 r/min离心10 min，弃上清。室温枯燥10~15 min，参加30 ml无RNA酶水溶解沉积，并于冰上放置1 h后放入-80 ℃冰柜冻存。

1.2.4荧光定量PCR检测

运用LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master试剂盒（罗氏,瑞士）在LightCycler 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪（罗氏,瑞士）上进行反响。反响体系：2×LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master，5 μl；10 μmol/L正向引物，0.2 μl；10 μmol/L反向引物，0.2 μl；cDNA 1 μl；无核酸酶纯水3.6 μl。PCR反响程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环（图1）。循环完毕后运用熔解曲线检测产品特异性：从60 ℃缓慢升温至97 ℃，每1 ℃搜集5次荧光信号。将β-actin作为内参基因，运用2-△△CT法核算DNMT及MeCP的mRNA相对表达量。

1.3计算学处理

选用SPSS 16.0计算软件，契合正态分布的mRNA相对表达量用均数±规范差标明，组间比较选用t查验；不契合正态分布的mRNA相对表达量用中位数（四分位距离）标明，两组间比较选用Mann-Whitney U查验。选用Spearman秩相关剖析年纪、疾病严峻度与DNMT及MeCP mRNA表达水平的相关性。P＜0.05为差异有计算学含义。

2成果

2.1一般临床材料

9例GPP患者中女人4例，男性5例，平均年纪（33.7±1.7）岁，其间病况轻度者2例，中度3例，重度4例。10例健康对照者中女人5例，男性5例，平均年纪（31.3±1.5）岁。GPP组和健康对照组间的性别和年纪无计算学差异（P＞0.05）。

2.2RNA质量判定

依据紫外分光光度仪检测成果，总RNA的OD260/OD280比值均在1.8~2.0之间，标明RNA纯度较高。用琼脂糖凝胶对RNA进行电泳，检测成果显现3条较明晰的条带，RNA纯度及完整性可满意实时PCR要求（图2）。

2.3荧光PCR定量成果

选用实时PCR荧光定量法检测9例GPP患者和10例健康对照者PBMC中DNMT及MeCP mRNA的表达状况（表2）。与健康对照组比较，GPP患者PBMC中的DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD4相对表达水平显着升高（P均＜0.05）。

2.4GPP患者临床表型与DNMT及MeCP mRNA表达水平的相关性剖析

DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD3、MBD4及MeCP2的mRNA表达水平与患者年纪和疾病严峻程度均无相关性（P均＞0.05，表3）。

3评论

本研讨发现GPP患者的PBMC中，DNA甲基化相关因子的mRNA表达量发作显着改动，其间DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2和MBD4的表达显着上调，提示DNA甲基化或许在GPP中起重要效果，患者年纪及病况严峻程度度与上述甲基化相关基因的表达不相关。

GPP发病机制杂乱，致病原因尚不彻底清楚，基因IL-36RN及CARD14在GPP的发病机制中扮演重要人物。2011年，Marrakchi团队［2］初次在突尼斯宗族性GPP患者中发现了坐落IL36RN基因的纯合子骤变IL36RN c.80C＞T（p.Leu27Pro），并将由IL36RN基因骤变发作反常IL36Ra而引起的宗族性GPP命名为DITRA［2］。同年，Onoufriadis等［13］对5例无血缘关系的欧洲GPP患者进行外显子测序，发现其间3例发作IL36RN基因低频骤变，2例呈现c.338C＞T(p.Ser113Leu)错义代替，而另1例呈现c.338C＞T(p.Ser113Leu)及c.142C＞T(p.Arg48Trp)错义代替的复合骤变，初次将DITRA概念从宗族性GPP扩展至散发性GPP。2012年，Jordan等［3］初次发现CARD14基因与GPP发病相关，并报告了1例海地GPP患儿带着重生胚系杂合骤变c.413A＞C（p.Glu138Ala）。继而Korber等［5］在欧洲GPP患者中发现了源自CARD14的p.Arg69Gln、p.Gly117Ser、p.Ser200Asn和p.Arg826Trp骤变，并证明这些骤变导致的CARD14功用缺点或许是GPP发病的重要遗传要素。2014年在19例与寻常型银屑病相关的GPP中发现2例（21.1%）患者带着CARD14基因 p.Asp176His骤变，带着率较对照组（3%）升高［14］。易感基因遗传方法尽管能够解说部分GPP的发病，但无法全面提醒性别、年纪及诱因对疾病发作开展的影响，无法回答感染、妊娠和特别药物运用等状况诱发GPP发作的机制。

DNA甲基化是正常胚胎发育的重要进程，具有多种功用，参加基因表达调控、染色质润饰、细胞分解和开展以及X染色体失活等进程［9］。DNA甲基化首要发作在CpG 5-胞嘧啶上，发动子区CpG岛一般处于非甲基化状况，基因正常表达。当CpG岛的甲基化状况发作反常改动后，影响基因的转录调控，使得基因处于缄默沉静或过度表达状况［9］。DNA甲基化的进程首要受DNMT催化完结甲基化进程［9］。DNA甲基化的润饰状况受必定条件影响，且随年纪改动发作改动。现在以为DNMT包含DNMT1、DNMT3a、DNMT3b。DNMT1或许与酶的活性、DNA结合调理有关，效果在于保持DNA的甲基化并将这种甲基化安稳传递给子代。DNMT3a和DNMT3b是人体首要的甲基化转移酶 ［15］。本研讨显现DNMT1在GPP患者中的表达较健康组稍微下调，而DNMT3a、DNMT3b显着上调，提示GPP患者体内存在DNMT状况反常导致的DNA基因组反常甲基化形式，DNMT1水平下调或许诱导炎症免疫相关基因甲基化水平下调，使得部分炎症免疫通路过度激活，诱发疾病，而DNMT3a及DNMT3b上调则或许使GPP患者某些炎症按捺基因如PDCD1缄默沉静，使得其按捺炎症才能下降，然后诱发GPP发作。

具有相同MBD的5种蛋白（MBD1、MBD2、MBD3、MBD4、MeCP2）经过辨认甲基化DNA参加转录按捺，被称为MBD宗族［16］。MBD 的存在方法为单体，其与其他蛋白质或复合物结合的方法或许并不安稳。MeCP2在体表里均能够按捺发动子区域的甲基化基因转录，但对非甲基化发动子并无效果，能够经过转录按捺区域和要害转录因子的相互效果按捺转录进程［17］。MBD1的相对分子质量在宗族中最大，能够与染色质相关因子构成复合物，结合在发动子区SP1位点按捺转录。MBD2蛋白参加发动子区高甲基化的基因缄默沉静，当高甲基化的发动子未与MBD2结合后，基因表达添加。MBD2或许具有去甲基化酶的效果，经过与组蛋白乙酰基转移酶基及TACC3蛋白构成复合物，使得发动子区域的甲基化缄默沉静基因康复活性。由此可知，MBD2的功用不只能够介导转录缄默沉静，还能够在甲基化发动子区域经过与其他蛋白质相互效果，在不改动甲基化状况的状况下，经过改动染色质的设想激活基因。MBD3与MBD2高度类似， MBD2能够与MBD3结组成异二聚体，进一步强化染色质的按捺状况。此外MBD3蛋白的MBD可与DNMT3a的N结尾相互效果。MBD4是仅有具有其他功用的MBD蛋白，其C结尾具有DNA批改酶活性，因而也归于DNA批改体系，能够辨认CpG位点错配的T或U并给予批改。MBD4是参加发动子区域高甲基化状况的重要因子，一起其批改活性关于保持发动子区域高甲基化状况也是必需的［18］。

DNA甲基化的进程十分杂乱，多种相关蛋白因子相互效果。本研讨提示GPP患者或许在不同甲基化催化因子的效果下发作不同基因的高甲基化及低甲基化状况，然后导致基因的低表达及过表达，激活相关炎症通路，一起也阐明GPP DNA甲基化水平的改动进程十分杂乱，甲基化的诱发、催化、保持甚至去甲基化进程由一系列的蛋白宗族及调理因子相互效果而成，而DNA甲基化的差异进程又同GPP的发作紧密联络。本研讨一起发现，患者的发病年纪及病况严峻程度与甲基化相关基因的表达无显着相关，提示甲基化尽管或许导致GPP的发作，但或许与其临床体现并无联络。

本研讨为回忆性，标本量较少，临床材料（如病况严峻程度等）的搜集或许存在必定偏倚,未来需大样本实验进一步验证。

跟着研讨的深化，DNA甲基化调控的杂乱机制终将逐步明晰，针对甲基化进程中不同因子表达水平的检测及相应生物制剂的研讨或许可为GPP的确诊和医治供给新的思路。

志谢:衷心感谢参加本项研讨的GPP患者及整体工作人员。

参考文献略

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